第二节 鉴定

支原体（Mycoplasma）是一泛称，一般泛指柔膜体纲中的任何一个种。国际上由“柔膜体纲分类分委会”负责对柔膜体纲的分类与描述进行修订。

柔膜体纲中的支原体仅由一层细胞膜包裹，无细胞壁，也不能合成细胞壁前体（如胞壁酸和二氨基庚二酸）。支原体微小，某些活的球状支原体直径在300nm内，活螺旋原体直径小于200nm，形态呈球形、螺旋形或线形。某些种是多形的，少数呈线形的支原体可产生分支呈丝状。多数情况下，支原体的形态与培养基的营养质量、渗透压及培养时间相关。某些种有专门的顶端结构，其上有黏附素，介导对真核细胞和组织的黏附。

柔膜体纲的基因组在530～2 200kb之间，DNA G+C（%）含量在23%～35%之间，少数种可达40%。基因组复制不一定与细胞分裂同步进行，因此，可见线形支原体的发芽和分段结构及传统二分裂状态。由于缺乏细胞壁，支原体对青霉素及其类似物具有天然的抗性。

多数可培养柔膜体菌为兼性厌氧，但少数为专性厌氧。在固体培养基上形成1～2mm的菌落，有的可小至0.01mm，生长时有穿透固体培养基生长的趋势。部分支原体可有运动功能，不形成芽孢。在适宜条件下，许多缺乏运动功能的菌种常形成“油煎蛋”样菌落，具有运动性的支原体形成的菌落常常呈扩散状，附近有卫星菌落。到目前为止，除了植原体尚不能人工培养外，其他有描述的种都能在人工培养基上生长。

支原体可能是共生菌，也可能是直接或间接的致病菌，某些种是脊椎动物、无脊椎动物或植物的致病菌，植物致病菌一般在昆虫体内繁殖和传播。

以前将对植物致病的大量柔膜体纲菌称为“支原体”样生物，现冠之以“植原体属（Phytoplasma）”。一些螺原体种也对植物致病，这些菌在宿主植物硬皮组织和同翅昆虫生物内生存。柔膜体纲的分类及其主要特征如表2-1所示。

一、柔膜体纲、目和科水平上的鉴定

（一）纲水平上的鉴定

柔膜体纲的鉴定，主要依据有无细胞壁、有无回复突变型、滤过性和核酸检测来确定。

1.无回复突变型

菌落在合适条件下（无抗生素等致L型细菌突变的因素存在）不会回复成有细胞壁菌，用于回复试验的培养基应为标准的细菌肉汤、半固体或传统的血琼脂。如为L型细菌，则克隆自行回复突变为有细胞壁的细菌。

2.细胞膜的超微结构

电镜超薄切片显示其仅为一层有细胞膜但无细胞壁的包膜。应注意的是，自然生态系统中存在着大量不可培养的无细胞壁细菌，因此有可能发现一种无细胞壁（但不是古生菌）但遗传发育上与柔膜体纲无关的细菌。

3.滤过性

柔膜体纲细菌均可通过450nm孔径的滤膜（用液体培养基培养菌试验），多数加压能通过200～300nm孔径的滤膜，但通过此孔径后，菌数量明显减少，而L型细菌一般不能通过这种孔径的滤器。

4.核酸检测

柔膜体纲基因检测包括：

（1）基因组大小：

一般为580～2 200kb，若基因组>3 000kb，可能为L型细菌。

（2）DNA G+C（%）含量测定：

若DNA G+C（%）含量>40%，则此菌很可能不属此纲。

（3）16S rRNA测序：

可通过细菌保守引物测序，并与基因库中16S rRNA序列比较其同源性，从而提供确凿的证据。

（二）目和科水平的鉴定

柔膜体纲的主要特征如下：①缺乏细胞壁，能在固体培养基上形成“油煎蛋样”菌落；②可通过220～450nm微孔滤膜；③基因组较小，碱基富含A和T；④在合适条件下无细胞壁菌株不能回复成有细胞壁菌。在鉴定目、科和属中的位置时，主要依赖形态、宿主来源、最适生长温度、培养和生化特征。在描述新的菌种时，需进行详尽的血清学分析以及培养和生化特征的描述，主要要求有：①命名合适的模式株；②指定其在该纲内目、科和属的位置，并选定合适的种加词进行种的命名；③列出模式株及近缘株与以前发表种不同的特征；④将模式株培养物保藏到国际认可的菌种保藏所。

柔膜体纲内目和科的鉴定需通过甾醇需求试验、细胞形态、菌落特征、最适生长温度、基因组大小和对氧的需求等来确定。

1.甾醇需求

柔膜体纲对胆固醇的需求常通过比较在含或不含胆固醇的培养基中的生长情况而获得。这些试验要求含不同脂肪酸和白蛋白的无血清培养基，增加浓度时应逐渐增加可溶性胆固醇（1～20μg/ml）的量，生长反应则通过测出总细胞蛋白或在固体培养基上菌落生长情况而测定：支原体科、虫原体科和螺旋体科的多数成员在无血清培养基中极少生长，但随培养基中胆固醇量增加，其生长量亦增加。无胆甾原体属、中间原体属、无甾醇支原体及某些螺原体可于无血清培养基中生长良好，在另加Tween-80的培养基中生长更好。

2.细胞形态

柔膜体纲细菌的形态在很大程度上取决于培养基的成分和培养时间。柔膜体纲新种分类位置的确定需用暗视野相差显微镜观察其对数生长期的典型形态。多数螺原体科成员在液体培养情况下常为螺旋状，显示较强的柔韧性，有时表现为平移运动。非螺旋菌为多形态，一般为小的拟球体、双极状，呈精细分支或不分支线状，长短不一。甲醇固定后用吉姆萨染液染色有助于某些支原体属、种形态的观察。

3.菌落特征

必须描述待研究菌在固体培养基上生长情况及其菌落特征。多数非螺旋柔膜体纲细菌可形成“油煎蛋”样菌落，但是许多螺原体属菌和少数非螺旋状菌在同样培养条件下不形成这种典型菌落。螺原体常形成扩散菌落，易形成卫星菌落，这与运动性细菌的生长特征类似。

4.最适生长温度

生长温度可用于区分某些科。螺原体目的螺原体属、中间原体属和螺原体属及无胆甾原体目的某些种于30～32℃生长最佳，而柔膜体纲内其他种则于37℃生长最佳。

5.需氧和厌氧生活

厌氧生活和对氧敏感的柔膜体纲细菌归为厌氧原体目，该目仅有一个成员——厌氧原体科。目前，这种菌仅在羊和牛的胃中发现。

6.密码子的使用

支原体目和螺原体目使用UGA作为色氨酸密码子，而无胆甾原体目和厌氧原体目成员仅用UGG编码色氨酸。

二、属和种水平的鉴定

（一）属水平的鉴定

1.支原体属

该属包括来自脊椎动物的非螺旋柔膜体菌，特征如下：①不是专性厌氧；②需胆固醇或甾醇才能生长，在固体培养基呈典型的“油煎蛋”样菌落，菌落直径<1mm；③生长温度范围为20～45℃，最适生长温度为37℃；④不水解尿素；⑤基因组大小为580～1 350kb, DNA G+C（%）含量为23%～40%。

2.脲原体属

与上述支原体属相同，但有下列特征：①基因组大小760～1 170kb；②能分解尿素产生CO₂与NH₃；③最适pH 6.0～6.5；④酶活性：氨肽酶、脂酶、α-磷酸甘油脱氢酶和L-组氨酸氨裂解酶均阳性，触酶与乳酸脱氢酶阴性。

3.红细胞体属和血巴尔通体属

此两属具有下列特征：无细胞壁的嗜血菌，由于专性血液寄生，曾归属于立克次体目、无形体科。不能人工培养，运动与生化反应尚不清楚。目前，根据16S rRNA的相似性、形态学、DNA G+C（%）含量和UGA作为色氨酸的密码子，将其归属于未定科，但它们的命名仍有争论。

红细胞体属：菌体黏附于宿主红细胞表面，呈球形，直径350nm，血液涂片染色排列可呈链状、杆状和环形状。该属主要通过血液或吸血节肢动物叮咬皮肤感染各种哺乳动物与人，临床综合征为急性致死性贫血到慢性隐匿性贫血，主要症状为贫血、发热、厌食、脱水、体重减轻和不育。感染动物可为带菌者。四环素治疗可减少外周血中的红细胞体，但不能彻底清除。

4.中原体属

该属均来自昆虫或植物表面，故重新分类为虫原体属。具有下列特征：①菌体为多形态，无动力，直径200～1 200nm；②能发酵葡萄糖，具有磷酸烯醇式丙酮酸糖类磷酸转移酶体系；③生长需要血清或胆固醇，温度为10～32℃，最适温度为30～32℃，不被0.01%～0.04%Tween-80抑制；④基因组大小为870～900kb, DNA G+C（%）含量为27%～34%。

5.中间原体属

该属具有下列特征：①菌体呈球形或短丝状，直径为220～300nm，有些种可达400～500nm；②多数种能发酵葡萄糖，具有磷酸烯醇式丙酮酸糖类磷酸转移酶体系；③生长不需胆固醇与血清，可在含0.04%聚氧乙烯山梨醇酐（polyoxyethylene sorbitan/Tween 80）的无血清培养基中生长，最适生长温度为28～32℃；④基因组大小为825～930kb, DNA G+C（%）含量为26%～32%。

6.螺原体属

该属具有下列特征：①菌体呈多形性，螺旋状、分支状、球形或卵形，直径一般为100～200nm，长为3～5μm；②兼性厌氧，不同种的生长温度为5～41℃，在固体培养基上菌落常呈弥散状，形状与边缘不规则，直径为0.1～4μm不等；③基因组大小为780～2 220kb, DNA G+C（%）含量为24%～34%；④带有染色体外的遗传物质，如噬菌体（SpV1～4）与质粒（pSci1～6）；⑤该属主要引起植物与昆虫危害，但它们之间的关系、致病与寄生关系尚不完全清楚。

7.无胆甾原体属

该属是从脊椎动物、植物或节肢生物分离出的非螺旋状柔膜体菌，具有下列特征：①菌体呈球形，直径为300nm或丝状，长2～5μm；②非专性厌氧，可在无甾醇的培养基中生长，最适生长温度为30～37℃；菌落呈“油煎蛋”样，直径为2～3mm；③多数种能发酵糖类，作为能量来源，不分解尿素与精氨酸；④基因组大小为1 500～2 100kb, DNA G+C（%）含量为27%～28%。

8.植原体属

该属是寄生于植物韧皮部，无细胞壁，尚不能人工培养的一类重要植物致病菌。它与柔膜菌纲内的甾醇体属、螺原体属系统进化关系较近，其主要特点如下：①菌体一般呈多形态，如球形、椭圆形、长杆状、梭形与带状等，直径60～100nm；②基因组大小为530～1 350kb, DNA G+C（%）含量为23%～30%；③基因序列分析证实，该属缺乏氨基酸合成、脂肪酸合成、氧化磷酸化、三羧酸循环基因，可依赖糖酵解途径产生能量；④带有染色体外DNA——质粒（1～4个），质粒大小在3～11kb之间，与基因重组与转移等有关。

9.厌氧原体属

从脊椎动物分离出的非螺旋状柔膜体菌，其特点如下：①菌体呈球形，直径500nm；②专性厌氧生长，并需要甾醇，在固体培养基上呈“油煎蛋”样菌落；③基因组大小为1 542～1 715kb, DNA G+C（%）含量为29%～34%；④最适温度37℃，最适pH 6.5～7.0；⑤能发酵碳水化合物，产酸（甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、琥珀酸等）、产气（CO₂、H₂）和乙醇。

10.无甾醇原体属

从脊椎动物、植物或节肢动物分离出的非螺旋状柔膜体菌，有如下特征：①形态与厌氧原体属相同；②专性厌氧，可在无甾醇的培养基中生长，最适生长温度为37℃；③DNA中G+C（%）含量为40%。

（二）种水平的鉴定

1.支原体种

支原体属目前包括117个种和4个亚种。种的确定应根据形态、培养、营养、生化反应、气体要求、温度和pH要求、对抗生素的敏感性、致病性、共生关系、免疫特征和生态环境、血清学反应和遗传特征，其中以血清学相似度最为重要。生长抑制试验、直接/间接免疫荧光和/或代谢抑制试验常用于种的区分。柔膜体纲分委会认为：DNA G+C（%）含量是鉴别种必需的指标，种间DNA杂交，杂交率为10%～40%；16S rRNA测序同源性>94%。支原体属主要菌种的特性见表2-2。

2.脲原体属不同种的特性

脲原体属的基本特征如下：①直径约为500nm，呈球形；②基因组大小为760～1 170kb, DNA中G+C（%）含量为25%～32%；③在固体培养基上培养48小时后长成直径为15～30μm的“油煎蛋”样菌落；④最适pH为5.5～6.5，不分解糖类与氨基酸，能分解尿素产生CO₂与NH₃；⑤为共栖或条件致病菌，主要寄生在脊椎动物（鸟和哺乳动物）。脲原体属不同种的区分主要依靠血清学试验、全菌蛋白质的PAGE电泳谱、全染色体DNA-DNA杂交和来源的不同。该属的模式种为解脲脲原体。不同种的某些特性如表2-3所示。

3.红细胞体属不同种的特性

该属有5个种，由于不能人工培养，其生化反应与生长温度仍不清楚。主要根据16S rRNA基因测序和某些种宿主特异性进行分种，红细胞体属种名及其主要特征见表2-4。

4.血巴尔通体属不同种的特性

该属有三个种，主要吸附到红细胞表面，不能人工培养，其生化反应与生长温度仍不清楚，主要依据寄生宿主、16S rRNA基因和DNA G+C（%）含量来区分。血巴尔通体属种名及其主要特征见表2-5。

5.虫原体属不同种的特性

虫原体属来自昆虫或植物表面，因此将它们重新分类为虫原体属。目前该属包括6个种。该属的模式种为埃氏虫原体（ELCN-1=ATCC 43707）。虫原体属的主要种特征见表2-6。

6.中间原体属不同种的特性

中间原体属来自昆虫或植物表面。该属11个种。其主要种的特征见表2-7。

7.螺原体属不同种的特性

该属支原体在对数生长期呈螺旋状，发酵葡萄糖产酸，对其他碳水化合物的发酵在不同种间有差异，模式种为柠檬螺原体（S. citri）。该属主要种名及其特征见表2-8。

8.无胆甾原体属不同种的特性

该属繁殖方式与支原体类似，可以发酵碳水化合物，生长不需要胆固醇和血清。该属的模式种为莱氏无胆甾原体。无胆甾原体属主要种名及其主要特征见表2-9。

9.植原体属不同种的特性

由于植原体不能人工培养，故其形态、生理代谢和生长温度了解甚少。目前国际上对植原体的分类命名采用贯以Candidatus（候选种）的暂时分类系统。植原体16S rRNA基因高度保守，与同属柔膜菌纲的其他成员相比，植原体16S rRNA一些区域有较大差异。利用这些不同序列，设计特异PCR引物，用于检测和鉴定植物及媒介昆虫中特有的植原体种。在自然条件下，植原体专性寄生于植物韧皮部，主要靠吸食植物韧皮部汁液的昆虫介体传播（如叶蝉、茶翅蝽、飞虱和蚜虫等），也可通过嫁接方式和菟丝子传播。该属的主要种名及其主要特征见表2-10。

10.厌氧原体属不同种的特性

该属有4个种，为牛与羊瘤胃中共栖菌，其致病作用不清楚。溶菌厌氧原体具有蛋白酶与细菌裂解酶，不溶菌厌氧原体缺乏这两种酶。通过凝集试验、改良代谢抑制试验和免疫扩散试验，结合16S rRNA测序和G+C（%）含量将其区分为4个种。该属的主要种名及其主要特征见表2-11。

11.无甾醇原体属种的特性

无甾醇原体属目前仅有一个种，即厌氧无甾醇原体，模式株为161株（=ATCC 27880）。DNA G+C（%）含量为40.2%～40.5%，为牛与羊瘤胃中共栖菌，其致病作用暂不清楚。

（吴移谋　顾伟鸣）