第一节 淋巴管注射法

淋巴管注射法是研究淋巴管的传统方法，至今仍是显示淋巴管最基本的方法，例如临床在癌手术中用淋巴管注射法显示癌的前哨淋巴结。多年来，淋巴管的注射技术和注射剂不断得到改进。

一、注射的方法

淋巴管注射有直接注射和间接注射两种方法。直接注射法是将有色的注射剂直接注入淋巴管或淋巴结，以使淋巴管和淋巴结充盈显色。间接注射法是将有色的注射剂注入器官的组织间隙内，通过毛细淋巴管壁进入管腔，从而使淋巴管和淋巴结充盈显色。

（一）直接注射法

Nuck首先将水银注入淋巴管取得成功，开创了淋巴管的注射方法。Cruikchanck改进了Nuck的方法，先向新鲜的尸体血管注入有色填充剂，以便与淋巴管相区别，然后将尸体浸入水中数日，由于组织的腐败作用，组织内即可产生气体，结果使淋巴管扩张，除去皮肤，很容易找到皮下淋巴管，将水银直接注入管内，即可显示出淋巴管和淋巴结。Mascagni进一步改进了水银注射的方法，用拉长的细玻璃插管注射，取得更好的效果。由于水银比重大，很容易胀破淋巴管，难以显示范围较远的淋巴管和淋巴结，为了观察到一条完整的淋巴管，常需进行补充注射。以后，人们又以各种色素取代水银进行直接注射，提高了注射的效果。由于淋巴管瓣膜的作用，直接注射的色素在淋巴管内只能向心流动，而不能逆流至细小的淋巴管及毛细淋巴管；此外，虽然色素在管内可扩散很远，能显示很远范围的淋巴管及淋巴结，但它向周围淋巴管的扩散则受到限制，仅能显示很小范围的淋巴管及淋巴结。现在已很少单独采用直接注射方法，只是作为间接注射法的补充，有时还使用此法，特别是在进行淋巴管造影时，先用间接注射法使淋巴管充盈显色，然后向显示出的淋巴管注入造影剂。

（二）间接注射法

间接注射法主要由Fohman提出，以后由Gerota加以完善，至今仍然是淋巴系统研究中最基本的方法。间接注射法也称为组织内注射法，是将有色的注射剂注入器官的组织间隙内，由于毛细淋巴管壁的通透性大于毛细血管，借助注射的压力和注射液内氯仿或乙醚的扩散作用，注射的色素即可进入毛细淋巴管，使毛细淋巴管、淋巴管及淋巴结充盈显色。间接注射的特点是从器官的一点注射，可以通过没有瓣膜的毛细淋巴管扩散至很大范围的淋巴管及淋巴结，从而显示出器官的淋巴系统。为了进一步观察较远范围的淋巴管及淋巴结，可以进行补充注射，即将注射剂直接注入显色的淋巴管，使色素扩散至更远处的淋巴管和淋巴结。

过去，对淋巴管间接注射法曾有不同的意见，例如Renyi-Vamos等（1960）认为，注射的色素不仅进入毛细淋巴管，也可能进入毛细血管，并且认为，侵入间质内的色素和充色的毛细淋巴管之间也无明显的界限，易造成人为的假象。根据我们的观察，如果注射的色素进入毛细血管，并不难区别，因为淋巴管的注射，是从一个器官的一点连续注入，所以进入毛细淋巴管的色素，必然延续至淋巴管及淋巴结。同样，如果色素进入毛细血管，也必将流入血管分支。淋巴管具有串珠形的外观，依此可与血管相区别。在透明铺片标本上观察，毛细淋巴管较毛细血管稍粗，且不均匀，毛细淋巴管网与毛细血管网的网眼形状也不相同。最主要的是毛细淋巴管壁的通透性较毛细血管大，所以注射的色素难以侵入毛细血管，除非是注射针头直接刺入血管腔内。王云祥等（1962—1966）用间接注射法注射过200个胃的淋巴管，从未见到胃的血管充色现象。在器官内淋巴管研究中，也常同时用墨汁注射血管，以观察两者间的关系，这样，淋巴管呈蓝色，血管则呈黑色，两者对比非常明显。

关于充色的毛细淋巴管和扩散至间质内的色素之间，也能加以区别。毛细淋巴管都相互吻合成网，并且和淋巴管相连；而扩散至间质内的色素则与此不同。毛细淋巴管无瓣膜，从一点连续注射时注射剂可在管内扩散，而使很大范围的毛细淋巴管显色。因此，在远离注射点取材观察时（透明或组织切片），于间质内应见不到色素，毛细淋巴管内的色素是由注入点的毛细淋巴管扩散而来，和该处的间质并无联系。总之，通过在双目立体显微镜下对透明标本和连续切片的观察，这些问题是基本上可以解决的。

二、淋巴管注射的注射剂

淋巴管注射的注射剂分为油性和水性注射剂两种。选择注射剂最重要的条件是色素颗粒小，容易渗入毛细淋巴管，在淋巴管内扩散力强，色素应不易褪色，并便于观察和照相；此外，用于活体淋巴管注射的注射剂必须毒性低，不损害机体和器官，而且注入后不应吸收过快，否则照相时已不能显影。淋巴管注射剂分为油性注射剂和水性注射剂。

（一）油性注射剂

各种色素都可用于油性注射剂的配制，其中以普鲁士蓝为最好。Gerota首先用普鲁士蓝配制油性注射剂，取得了良好的结果。他的配方是普鲁士蓝2g，加松节油3ml，充分研磨后加乙醚15ml。王云祥等从1959年开始用淋巴管间接注射法研究淋巴系统，所用注射剂的配方是取普鲁士蓝油画颜料30g，加氯仿100ml，充分研磨后，用20层纱布过滤，放置一周以后使用。油画颜料易于溶解，氯仿较乙醚挥发慢，这些都利于淋巴管的注射。在普鲁士蓝氯仿溶液内也可加入2~3ml的松节油，即先将普鲁士蓝和松节油充分研磨，然后再加氯仿稀释。松节油有一定的透明作用，并有利于普鲁士蓝的研磨和稀释；但是，因为我们使用的是油画颜料，这种颜料易溶于氯仿，所以一般也可不加松节油，仍能得较好的注射效果。为了使注射剂的色素颗粒能彻底稀释均匀，放置时间越长，注射的效果越好；但配制好的注射剂，应注意密封保存，以防止氯仿挥发。

多年来，国内很多学者多是采用我们的注射剂配方进行淋巴管间接注射的。色素油性注射剂仅用于尸体标本的淋巴管注射。

在淋巴系统的研究中，有时使用多色性淋巴管注射方法，即从几个器官或同一器官的不同部位注入各种颜色的注射剂，来观察各部分淋巴管间的联系。例如，我们曾由食管注入普鲁士蓝氯仿溶液，而从胃注入铬黄氯仿溶液，呈蓝色的食管淋巴管与呈黄色的胃淋巴管如汇入同一淋巴结，则该结将呈现绿色。为了进行多色性淋巴管注射，常分别采用普鲁士蓝氯仿溶液、铬黄氯仿溶液、大红氯仿溶液和炭黑氯仿溶液，也可用墨汁水溶液。铬黄、大红和炭黑也都是用油画颜料，其配制方法和普鲁士蓝氯仿溶液相同，但因其色素颗粒较大，注射效果次于普鲁士蓝，且易堵塞针头，配制的注射剂也容易沉淀，用前必须充分摇动容器，以使其稀释融合均匀。因铬黄、大红和炭黑存有上述缺点，所以除在多色性注射时使用外，一般很少单独用其注射淋巴管。

（二）水性注射剂

最常用的是墨汁注射剂。Dola-Rosa首先使用中国墨汁注射淋巴管，取得良好效果。使用的配方是取蒸馏水100ml和明胶5g，加温使其融化，然后加中国墨汁20g，充分稀释融合后用20层纱布过滤备用。也可不用明胶，取中国墨汁10ml，加蒸馏水10ml，充分混合后过滤备用；或不用蒸馏水稀释，将中国墨汁过滤后即可使用。

除墨汁注射剂外，2%的柏林蓝水溶液、书写用的蓝黑墨水和各种颜色的水彩画颜料加水稀释成10%~20%水溶液，过滤后都可使用。水性注射剂易向周围组织渗出，有的且易褪色，注出的标本没有油性注射剂美观，所以，一般很少使用。没有毒性的水性注射剂可用于活体淋巴管注射（在活体淋巴管注射项内详述）。

三、间接注射的注射部位

间接注射的效果好坏，与标本是否新鲜和注射的部位是否适当有重要关系。注射内脏淋巴管，标本愈新鲜愈好。注射四肢和躯干淋巴管，则需过尸僵期，即24小时后再注射。如不能及时注射，可利用自然条件或置于冰箱内冰冻保存，解冻后注射效果仍然较好。各种年龄的尸体均可用于淋巴管注射，一般多用胎儿和小儿尸体。间接注射的注射部位，可根据身体各部的淋巴分布的规律来确定。

观察四肢的浅淋巴管，常由指和趾甲根部、甲床、指和趾的两侧缘、指和趾间蹼以及手、足的两侧缘注射，也可从小腿及大腿的外侧注射，这样可不影响上行的集合淋巴管。如观察四肢深淋巴管时，可由掌腱膜或跖腱膜、手和足的内侧、外侧肌群注射，也可由其他肌群注射，有时从骨膜、筋膜、关节囊及韧带注射，以显示该部的深淋巴管。如上所述，根据四肢淋巴管走行的方向，四肢淋巴管的注射是从远侧开始，然后逐次向近侧注射，以便显示四肢较大范围的淋巴管（图2-1）。

观察头颈部的浅淋巴管可沿头颈部前、后正中线、下颌下缘、眼睑上缘、眼睑下缘和唇红缘等处行间接注射（图2-2）。深部淋巴管主要由头颈部的脏器注射（方法后述）。

躯干体壁部分的浅淋巴管，可由躯干前、后正中线和脐周围、乳头、乳晕周围皮肤做间接注射。

在胸、腹腔的中空性器官，为了观察器官的淋巴流向，可由浆膜下注射，因为中空性器官的淋巴管大部分汇入浆膜下淋巴管；后者合成集合淋巴管走向局部淋巴结。所以由浆膜下注射，可显示该器官的集合淋巴管和局部淋巴结。但是如观察器官内淋巴管的构筑，则需按层注射。例如胃和肠应分别由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜下层注射（图2-3），食管和气管可进行黏膜层、黏膜下层及肌层注射。

在实质性器官，可进行浆膜下注射，以观察浅层淋巴管的配布和器官的淋巴流向，也向实质内注射，以观察深部淋巴管的配布和器官的淋巴流向（图2-4）。因为有些实质性器官（肺、肝等）的浅层及深部的淋巴流向不同，所以为观察器官的淋巴流向，需分别进行浆膜下及实质内的注射。观察器官的淋巴流向时，可在该器官组织内注射的基础上，进行显色淋巴管及淋巴结的直接注射，以便显示范围更远的淋巴管和淋巴结。

四、间接注射的注射步骤

注射前将标本用50℃温水浸泡30分钟，如注射内脏，可用温毛巾热敷，以使淋巴管扩张，提高注射效果。

一般用2ml注射器，26号（新4号）斜口针头注射。吸入注射剂后，排出气泡，用纱布将针头拭净，按大致和器官平行的方向刺入，针头斜面向上，用拇指缓慢推入，用力不能过猛。注射的速度应以注射剂在淋巴管内的扩散情况而定。注射内脏淋巴管时，1ml注射剂需2~3分钟，注射四肢时则需更多的时间。内脏淋巴管的注射，可直接观察到淋巴管和淋巴结充色情况，可用湿棉球或纱布轻轻推压注入点的组织或显色的淋巴管，以显示较大范围的淋巴管和淋巴结。如发现注射剂在组织间隙内扩散，或淋巴管胀破，应立即停止注射，重新选择注入点。注射四肢和体壁皮下的浅淋巴管时，可根据注射时组织内的阻力大小，来判断注射的效果，如阻力过大，甚至出现返回喷射现象，则是针刺过浅（针尖在皮内）；反之，阻力过小，常由于注射点过深（针尖在皮下组织）所致，应及时调整深度。如果阻力突然下降，则是淋巴管被胀界处。注射后活动各关节并进行按摩，这有助于注射剂在管内的流通扩散。破所致，应立即停止注射，重新选择注射点。注射肢体淋巴管的最好部位是在皮肤与皮下组织的交界处。注射后活动各关节并进行按摩，这有助于注射剂在管内的流通扩散。

在淋巴管注射中，应尽力从器官的一个点做连续注射，即不要轻易改换注射点，因为即或注射效果显著非常理想，在注射点周围也有一定的污染，注入点愈多，污染愈严重。根据我们的经验，在注射小儿的脏器（例如胃）时，如果选择的部位及深度适当，有可能从一点连续注射，使整个器官的淋巴管完全显色，取得非常美观洁净的标本。注射点较少，周围的组织污染轻微，淋巴管及淋巴结的显色范围大，这是淋巴管注射成功的标志。

淋巴管间接注射是将注射剂注入器官的组织间隙，使其透过毛细淋巴管壁而进入淋巴管，所以间接注射是有一定难度的。根据我们多年的工作体会，注射标本的绝对新鲜、理想的注射剂、规范的注射部位和适当的注射压力是注射成功的主要因素。

五、注射后标本的处理

标本注射后，用煤酚皂溶液洗净外渗和污染部分，并用流水冲洗，然后以10%甲醛溶液固定1周，根据观察的目的可作以下不同的处理。

（一）标本的解剖

为观察肢体的浅、深淋巴管和淋巴结以及内脏的器官外淋巴管和淋巴结，可用肉眼或借助立体显微镜进行解剖。淋巴管的管腔细小，管壁菲薄，肢体浅淋巴管多藏于皮下脂肪之中，深淋巴管则伴血管和神经走行，并被结缔组织所包绕。因此，在剖查淋巴管时，必须十分细致耐心，一般是用尖细的刀、剪、镊子和分离针等精细工具，进行钝性剥离。先找出显色淋巴管的起点，然后沿其走行方向，除去周围的结缔组织和脂肪，暴露出显色的淋巴管，尽力使淋巴管保持完整的形态和正常的位置。注射后的标本也可立即进行解剖，然后再用甲醛溶液固定。未经固定的标本的淋巴管显色明显，组织比较疏松，易于解剖操作，但如果损伤了淋巴管，则注射剂外渗而污染周围组织。

（二）铺片透明标本

为研究器官内淋巴管的配布，可做淋巴管铺片透明标本。在中空性器官（例如胃、肠），可按层分离成黏膜层和肌层，或肌层和浆膜层的薄片，并切成3~4cm2小块，用丝线固定于载玻片上。胎儿和小儿的某些中空性器官（如喉、直肠、膀胱），因形体较小，所以可将其纵行切开，然后整个器官固定于一个载玻片上，以便观察整个器官淋巴管的配布情况。实质性器官切成厚0.2~0.5cm的薄片（3~4cm2）。用流水冲洗24小时后，再用各级乙醇（50%、70%、80%、90%、95%、100%）脱水，每级放置3天。然后置于冬青油内透明，2~3日内即可见到清晰、美观的淋巴管透明标本（图2-5，6），放入合碟内，用双目立体放大镜或在立体显微镜下观察器官内淋巴管的构筑及其相互间的联系。

（三）切片染色

选注射较好的部位取材，用火棉胶或石蜡包埋，切成厚10~30µm的连续切片，苏木素、伊红染色。有时为观察淋巴管的联系，可切80~100µm的连续切片，不进行染色。切片标本可显示淋巴管的层次关系（图2-7，8），所以可配合铺片透明标本系统地观察器官内淋巴管的构筑。

六、活体淋巴管注射法

在癌的根治手术中，对患者器官可做活体淋巴管注射，以显示器官的淋巴管和局部淋巴结。器官的局部淋巴结的形体很小，结的颜色与周围组织很是近似，有些淋巴结的位置也很隐蔽深在，所以在癌的根治术中不易辨认。1950年，Weinbery在胃癌根治术中，首先采用活体淋巴管注射法，来显示胃的局部淋巴结。以后，Eichner等（1954）在卵巢手术中，Haagensen（1972）在乳癌的根治术中也使用了活体淋巴管注射。1980年，Sarrazin在胃癌根治手术中，用活体淋巴管注射法，系统地观察了胃的局部淋巴结。活体淋巴管注射不仅有利于进行癌的根治手术，同时也是研究器官的淋巴流向的一种好方法。

在癌的根治手术中，活体淋巴过注射可确认患癌器官淋巴转移的前哨淋巴结。Cabana（1977）首先提出了前哨淋巴结sentinel lymph node（SLN）的概念，即首先接受器官淋巴引流的淋巴结，也必是癌转移的第一站；它可作为屏障暂时阻止癌细胞的进一步扩散，并提出切除前哨淋巴结检查器官受损状态，再确定是否进行大范围的淋巴结清除术。但是对于一个患癌器官哪些淋巴结相当是它的前哨淋巴结，常存有不同的意见。例如，Bennedetti-Panicip（2000）和Suprasert等（2005）认为，子宫旁淋巴结为子宫颈癌淋巴转移的前哨淋巴结；而Sakurag（1999）和Malur等（2001）则认为，闭孔淋巴结为子宫颈癌的前哨淋巴结。根据我们（2014）的研究，除上述子宫旁淋巴结和闭孔淋巴结外，髂外淋巴结、髂内淋巴结和髂间淋巴结也可能是子宫颈癌的前哨淋巴结。

活体淋巴管注射最重要的是注射剂没有毒性，一般可使用2%的滂胺天蓝（potamine sky blue），或2.5%～11% Patent蓝、2%～4%天蓝（sky blue）；这些色素的着色力强，吸收迅速，并且毒性较小。活体淋巴管的注射方法，基本与间接注射法相同。用26号针头，2ml注射器，在术中打开腹腔后立即进行注射。在中空性器官（如子宫），应由肌层注射，因为肌肉的张力和收缩有助于注射剂在淋巴管内的流动。根治手术可在注射后15～30分钟开始，这样可显示较多的局部淋巴结。有时在手术前1天先进行注射，因注射以后24小时所显示的淋巴结最为广泛。

活体淋巴管注射使局部淋巴结染成蓝色，所以在根治手术中容易辨认，即或埋藏在脂肪内的小淋巴结也能看清，从而有利于将其彻底清除。但在手术过程中，应避开已染色的淋巴结，用镊子夹住周围的脂肪组织进行剥离，以便防止已有转移淋巴结中癌细胞的播散。如果有些淋巴结充盈不良，即不完全显色或显色不匀，则有可能是淋巴管和淋巴结被癌细胞堵塞的结果，表明该部已有癌转移，所以在手术中进行活体淋巴管注射，也是观察癌转移情况的一种方法。此外，注射后的淋巴管也呈蓝色，其轮廓和走行关系非常明显，在手术时应将其结扎，以减少术后淋巴囊肿的发生。

在手术过程中进行活体淋巴管注射，要求熟练掌握注射技术，以便能迅速显示出局部淋巴结，达到根治手术的目的，否则会给患者造成负担，影响手术的进程，这也是活体淋巴管注射在临床未能广泛开展的一个因素。