2.1 一般杀菌机理
按照Paul Ehrlich(1908年诺贝尔奖获得者)的观点,杀菌剂的抗菌灭菌作用首先来源于活性物质与细胞之间的物理、化学反应。两者之间先建立结合,然后再发挥作用。对微生物的可能作用位点有细胞壁、细胞膜、细胞质(包括细胞器)和细胞核,对细菌的可能作用位点见图2⁃1。不同杀菌剂作用活性位点并不完全一致,不同杀菌剂的作用位点概括见图2⁃2。值得注意的是,很多杀菌剂(防腐剂)可能同时作用于不同的活性位点,并且可能作用的活性位点受杀菌剂活性物质浓度的影响,有些时候受作用的活性位点或者说杀菌机理是浓度依赖性的,在低浓度时体现特定目标效应,在高浓度时体现为无特定作用目标的细胞破裂。例如低浓度的双酚A或三氯生,对与细胞脂肪酸生物合成有重要意义的烯酰基⁃酰基载体蛋白还原酶有特定抑制作用;在高浓度时,将导致细胞膜破裂和细胞质沉淀。其他影响杀菌剂作用机理的因素还包括菌种、暴露时间、温度、pH值、有无金属离子、金属离子螯合剂、杀菌剂中和剂等。
图2⁃1 杀菌剂对细菌的可能作用位点
图2⁃2 杀菌剂的可能作用位点概要图
大部分杀菌剂对材料的保护作用可以被认为来源于杀菌活性物质的亲电活性、膜活性或能形成螯合物。杀菌剂与微生物的作用过程第一步是发生在细胞表面与活性物质之间相互作用的物理过程:扩散作用和静电吸引。根据微生物细胞的化学和功能生理学理论,杀菌剂在到达发挥其抗菌功效的可能作用部位前都经历了很长的征程,而细胞的能量代谢、蛋白质合成和营养吸附,都发生在细胞膜上。然后如果活性物质的物化性质允许的话,才是活性物质穿透细胞膜。根据Bergethon的说法,这个穿过膜的传输过程可分为被动传输或辅助(主动)传输。被动传输源于膜两边化学势的差别,是组分沿化学势梯度的扩散。通过膜的通量的速率与化合物从本体溶液扩散到膜表面上的运动有关。然后,透过膜的运动将取决于在该膜环境中该化合物的扩散系数。最后,化合物必须从膜上解吸并扩散到膜的另一侧本体相中。在脂质相中溶解度非常低的分子需要辅助转运。因此,这些分子的运输将非常缓慢。由两亲性分子携带,或者通过螯合作用会增加它们的脂溶性。例如,将8⁃羟基喹啉转化为铜⁃8⁃羟基喹啉,则它在脂质屏障上的运动可以更便利。
下面举例说明具有膜活性或亲电活性的杀菌剂活性物质作用机理。
2.1.1 膜活性杀菌剂
膜活性杀菌剂包括醇类、苯酚类、水杨酸类、二苯脲类、二苯脒类、双胍类、季铵盐类等具有阳离子性质的活性物质如有螯合性质的唑类等。许多能够与金属阳离子复合的杀菌剂也呈现出膜活性,因而也可视为膜活性杀菌剂。膜活性杀微生物剂首先或多或少地非特异性吸附(结合)覆盖于微生物的细胞壁而起作用,该过程最初是可逆的,特别是当加入试剂被稀释到非致死浓度时并且很快可以恢复平衡时。吸附过程引起外膜和细胞壁的变化。这些外部屏障在杀菌剂的作用下最终会失去其完整性,从而杀菌剂分子可以接触到细胞膜,进而发挥出它们的致命作用:扰乱细胞膜的半透性,抑制细胞膜上的酶,使细胞质的重要成分逸出,细胞质出现沉淀以及最终细胞解体。
【实例1】 苯酚衍生物
未解离状态的苯酚衍生物才有杀菌作用,在这种状态下它们对微生物细胞带负电的表面表现出亲和力因而才有膜活性,而带负电的阴离子被排斥(微生物细胞膜一般呈负电性),但是,某些酚衍生物即使在pH值高达10~11时也呈现出杀菌效力。例如山梨酸或苯甲酸仅在酸性介质中用作有效防腐剂(pH值最高4.5),而对羟基苯甲酸盐即使在pH值高达8.5的弱碱性介质中也有活性。通过在苯核上引入不同的取代基,可以以各种方式影响酚分子的杀菌活性。苯酚的烷基化将降低酸度和水溶性,增加脂溶性而呈现更高的表面活性,这些性质变化使其抗微生物功效增加。酚卤化生成苯酚卤代衍生物,其酸度和抗微生物效果随着引入的卤素原子数的增加而提高。
【实例2】 季铵盐型(QACs)
季铵盐型阳离子表面活性杀菌剂被微生物细胞带负电荷的表面吸引,可强烈地与细胞壁的磷脂的阴离子相互作用吸附。因此导致细胞壁失去其作为保护屏障的功能,使得活性成分能够渗透到细胞膜中。阳离子杀微生物剂损害了细胞膜的渗透性,直到细胞质膜不再起半透膜的作用。QACs的杀菌活性取决于它们的结构和大小,有12~16个碳原子组成的长链烷取代基对其活性至关重要。在pH≤3时,QACs基本无效,因带负电荷的细胞表面被质子化而被保护。常用季铵盐阳离子表面活性杀菌剂见图2⁃3。
图2⁃3 常用季铵盐阳离子表面活性杀菌剂
2.1.2 亲电活性杀菌剂
目前使用的多数杀菌剂属于亲电活性剂。包括醛、带有活化的N—S键化合物、有机金属化合物等。这些物质的杀菌效力是由于它们具有高电子密度的底物,例如微生物细胞的亲核组分,因而导致亲电加成或取代。微生物细胞上和细胞中的亲核反应活性位点是氨基酸、硫醇以及氨基酸和蛋白质中的酰胺基团。这些都是酶的必要组分,因而亲核位点基团与亲电子杀菌剂的反应导致酶被抑制。亲电活性物质的杀菌活性随其亲电性程度而增加,亲电程度主要取决于物质的组成和结构,即取决于电负性基团的电子吸引能力。在还未到达革兰氏阴性菌外细胞膜和周质并最终作用于细胞膜上的靶点的途中,亲电活性杀菌剂可能会与许多反应位点反应。这并不意味着杀菌剂一定失活,有时其活性甚至增加。而这一切都取决于活性组分的化学结构。亲电活性杀菌剂的优点是它们本身是非持久性的可以被降解而且不会在环境中积累,这超过其不太稳定以及活性不够持久的缺点。
【实例3】 醛类物质发挥活性的途径(图2⁃4)
图2⁃4 醛类物质活性作用示意图
【实例4】 带有活性N—S键活性物质作用途径(其一)(图2⁃5)
图2⁃5 带有活性N—S键活性物质作用途径之一
当然杀菌剂分类标准不统一,也可按照其他方式进行分类,比如更细化的活性物质作用位点或作用机理。下文将对工业上常用的有机杀菌剂作用机理展开简要阐述。