无论是病毒载体的基因修饰还是非病毒载体的基因修饰用于治疗组织再生均存在一定安全性问题，主要包括以下几个方面。

基因治疗组织再生存在的最致命的风险是宿主的免疫应答反应。无论是病毒载体还是非病毒载体均具有一定的免疫原性，当一种病毒载体或新型基因产物导入宿主机体后，机体的免疫系统将其确认为非己，并启动免疫应答反应。

在目前所应用的各类病毒载体中，腺病毒的免疫原性最强，所导致的免疫应答反应最明显，如何克服宿主机体的免疫反应成为腺病毒应用于基因治疗的最大障碍。腺病毒载体诱导机体多重免疫反应:腺病毒转染细胞过表达目的基因产物或“非己”转基因产物激活细胞毒性T细胞启动非特异性免疫应答反应;腺病毒衣壳本身即可诱导特异性免疫中的体液免疫反应，产生病毒中和抗体和强效细胞因子介导炎症反应;腺病毒转染细胞也可通过腺病毒衣壳成分与MHC-Ⅰ类分子相结合从而激活体内预存的细胞毒性T细胞引发非特异性免疫应答。这些不足限制了腺病毒在治疗需长期表达目的基因的疾病的应用。在此基础上敲除所有腺病毒的编码序列，只含有腺病毒DNA复制和包装的顺式作用元件，需要辅助病毒为其反式提供腺病毒载体包装需要的所有蛋白，制备出全缺失腺病毒载体，即辅助病毒依赖型腺病毒载体。改进后的腺病毒载体具有转基因表达时间长，副作用小等优点。全缺失腺病毒载体的应用明显减低了载体介导的细胞因子免疫应答，然而有证据显示在大鼠大脑，全缺失腺病毒载体仍具有诱发免疫炎症反应的可能。不适当的免疫炎症反应的激活具有很高的临床风险，在1999年治疗鸟氨酸氨基甲酰转移酶临床实验中，出现一例腺病毒载体引起强烈的全身免疫反应，引起发热、弥漫性血管内凝血、多器官功能衰竭，最终导致患者的死亡。与药物的副作用相似，病毒载体引起的免疫炎症反应以及其他毒副作用与病毒载体的使用剂量相关，然而不同个体对病毒载体的免疫应答反应强度不同，在临床研究中很难准确评估病毒载体的安全使用剂量。

与腺病毒载体相比较，其他病毒载体的免疫原性相对较弱，例如慢病毒载体和腺病毒相关病毒载体的病毒蛋白基本上不引起免疫应答或炎症反应，但目的基因产物的表达仍可激活细胞毒性T细胞的，尤其是在病毒载体转染细胞为树突状细胞之类抗原递呈能力强的细胞时该现象更加明显。另外病毒载体的给药途径对免疫反应的影响也是很大的。

在机体体液免疫系统中预先存留一定的抗体用于抵抗野生型病毒载体，这些预留的抗体阻碍了病毒载体的使用。在体液中循环的病毒中和抗体可有效地抑制病毒载体的转染效率。通过改变病毒衣壳血清型，从而降低体液免疫对腺病毒载体记忆腺病毒相关病毒载体的免疫应答，然而如何克服转基因产物蛋白引起的体液免疫应答成为基因治疗的临床难题。

野生型病毒载体在机体内能够诱发免疫反应，因机体屏障的限制作用感染途径有限，然而重组病毒载体无此物理途径的阻碍。腺病毒载体和全缺失腺病毒载体是自然条件下不能感染中枢神经系统，然而同样是这两种病毒载体当注射入大脑后能够有效地感染神经系统。在一定条件下，病毒载体联合应用的风险大于单独应用，全身给药的载体常常会导致不必要的载体摄入。即使是载体的局部释放仍可泄漏或传播至周边组织。转基因的表达可以被限定到特定的细胞类型，甚至通过组织特异性/可调节启动子的开、闭来进行限制，然而病毒颗粒自身即可诱发强烈的免疫排斥反应。

如前所述，有害的免疫排斥反应和其他毒副作用的严重性和风险大小与载体投递剂量密切相关。增加基因转染特定细胞群的转染效率，降低载体的使用剂量，从而有望降低基因治疗的潜在风险。非特异性/低效率吸收等问题的解决期望通过修饰病毒载体衣壳开发转导靶向载体而实现。

基因整合性病毒载体大多数来源于反转录病毒，转染可复制细胞可获得稳定的基因表达。目前的观点认为反转录病毒基因组整合到宿主染色体内是随机的，存在千万分之一的风险扰乱细胞周期造成恶性肿瘤。癌变的发生是多个基因病变的结果，尽管在体外转基因实验中超过千万的细胞进行反转录病毒修饰，基因插入导致的突变引发恶性肿瘤发生的风险仍然是可以忽略不计的，然而在特定条件下的转基因治疗中，这种风险仍然是存在的。最近的一项研究发现骨髓基质干细胞转染反转录病毒载体在小鼠体内植入并扩增最终诱发白血病，此项研究中的转染基因本身具有促进增殖能力，癌变的发生被认为是反转录病毒载体基因整合到染色体特定部位的同时表达具有促增殖能力的转基因蛋白，两者相互作用最终诱发了急性髓性白血病的发生。在一项临床试验中，反转录病毒载体用于治疗重症联合免疫缺陷，在治疗成功的11例患者中出现2例明显反转录病毒载体基因组整合而引发的白血病样障碍。另有研究显示反转录病毒的基因组整合并不像之前认为的是随机的，在细胞培养中对人类免疫缺陷病毒HIV的整合位点研究分析表明，人类免疫缺陷病毒更倾向于整合到转录活跃区域基因而非染色体的非编码区。

在反转录病毒载体治疗重症联合免疫缺陷的病例中，病毒载体转染细胞增殖能力显著增强，增加了恶性方向发展倾向。目前必须解决的问题是:在使用其他基因组整合病毒载体时是否存在类似的风险。克隆扩增是细胞肿瘤性化发展的一个危险因素，基因整合病毒载体在高度分化组织中的应用并不是为了提高细胞的增殖能力，因而诱发癌症的可能性是很低的。目前研究的热点主要集中在如何提高现使用基因整合病毒载体安全性(例如在病毒载体骨架结构中整合入“自杀基因”从而防止肿瘤的发生)以及研发能够在预定位点特异性整合的新型病毒载体。

基因治疗方法中，病毒载体的投递具有更高的转染效率和更持久的基因表达，然而随之而来的细胞学毒性，免疫原性，致突变性，以及靶向性的缺乏等缺点促使了新型非病毒载体的研发。与病毒载体相比，非病毒载体主要是指质粒DNA，质粒DNA来源于细菌，其主要优点是不会刺激引起任何体内预存的免疫反应。仅当非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸序列(即CpG序列)与脂质体结合时产生细胞学毒性。此外质粒DNA的局部控释比较容易实现，质粒DNA在血液中的转归率非常高，可以最大限度地减少质粒DNA在非目的组织的扩散。因而对质粒DNA的使用剂量无限制，且质粒DNA的高效转染在且很多种细胞中均可实现。质粒DNA中含有病毒启动子序列，但并不会在细胞内整合入基因组之中。然而非病毒载体的转染效率低，在体内使用时尤为明显。

直接在目的部位注射裸DNA的转染效率低，近年来提高非病毒载体的转染效率的研究主要集中在非病毒载体的转染方式上，包括:颗粒介导的基因转染，微种植技术，超声介导基因转染，电转染等。粒子介导的基因转染采用了“基因枪”技术，尽管转染效率没有明显的提高，且有诱发局部炎症倾向，然而离子介导的基因转染允许同时传递多种基因载体。

Eriksson等人开发了微种植技术，即直接在局部组织多个部位注射质粒DNA。微种植技术提高局部基因表达水平，但仅适用于浅表组织的基因转染表达。将裸DNA质粒暴露于中等强度的超声环境中，显著提高了质粒DNA的表达能力。Lawrie等人的研究发现，质粒DNA在超声作用刺激后，荧光素酶报告基因的表达强度增强了10倍以上。对超声介导的基因转染技术进行优化，借助微泡辅助基因转染，实现了体内外非病毒载体转染效率的提高。另一种方法是电转染，通过电穿孔的方式将非病毒载体导入细胞内。有研究显示电转与超声-微泡辅助转染方式相结合的基因转染方式比单独电转方式的基因表达效率提高4倍以上。非病毒载体转染技术的提高，使非病毒载体在临床上具有较好的应用前景。然而与病毒载体相比，其转染效率仍然较低。目前在非病毒载体转染方式中，脂质体的转染被认为是最具有应用前景的，局部直接注射脂质体-DNA复合物的转染效率更为可靠。

病毒载体和非病毒载体均存在一定的优点及缺点。目前有学者将病毒载体和非病毒载体相结合，将病毒载体或病毒载体片段导入基于阳离子亲和力转导的非病毒载体系统中，将病毒载体生存必需的功能性组件整合在一起模仿病毒核酸载体，显著提高整合载体的转染效率。例如将腺病毒六邻体蛋白的掺入显著增加聚乙烯亚胺-质粒DNA载体的核酸导入，提高其基因表达水平。另外人工模拟脂质体复合物将反转录病毒用于浓缩质粒DNA，模拟腺病毒载体，非病毒载体也被设计为通过受体介导的方式进入细胞。在早期的研究中，由于细胞内体逃逸问题的存在，非病毒载体常常不能有效地转导入细胞。在非病毒载体系统中，病毒的膜融合肽或烯烃类聚合物的掺入能显著提高基因传递的能力。在体外研究中，腺病毒聚氯蛋白被用于提高非病毒载体的转染能力。

将病毒载体与非病毒载体结合可联合其优点，如已被开发的病毒-阳离子脂质体-DNA复合物，“日本血凝病毒”脂质体，阳离子脂质体-DNA与“水疱性口炎病毒”来源的膜表面蛋白G混合物等。