第一节 用酶组织化学和免疫组织化学方法显示淋巴管深入研究器官内淋巴管的微细分布

过去，解剖学者使用器官内色素注射组织切片和铺片透明法、集合淋巴管结扎（使器官内淋巴管扩张）组织切片法、动脉内墨汁硝酸银水溶液注射法（血管内有墨汁颗粒，淋巴管壁内皮细胞银染）以及电镜观察等方法，对器官内淋巴管做了大量的研究工作，写出不少的专著；但是，关于各器官淋巴管的微细分布情况常有不同的记载，甚至对一些器官内是否存在淋巴管的问题，也有完全不同的见解。这主要是因为淋巴管细小，并且在组织切片上呈塌陷状态而不易显现，并且与小血管的区分也不明显，根据很多研究报道可以看到，使用不同的研究方法，有时可取得不同的结果，即对器官内淋巴管不同的记载，可能与研究方法有一定的关系。采用什么方法才能客观地区分淋巴管和血管？这是一个关键的问题。近年来，有些学者用酶组织化学和免疫组织化学方法使淋巴管和血管显示不同的颜色，从而明显地区分出淋巴管和血管，取得很多新的研究结果。

一、淋巴管酶组织化学显示法

20世纪80年代，Heusermann提出在淋巴管壁的中层和内皮细胞显示强烈的5′-核苷酸酶（5′-Nase）活性，而毛细血管壁则明显的低或无；但是，碱性磷酸酶（ALPase）活性则在血管壁呈现强阳性，淋巴管上缺乏。Werner等（1987）根据上述的淋巴管壁和血管壁两种酶活性的差异，应用酶组织化学染色观察了咽的淋巴管；Kato（1990）采用5′-Nase-ALPase双重染色法研究了大鼠舌、胸腺等器官的淋巴管；我们（1992—1998）用5′-Nase-ALPase双重染色法并结合半薄切片和超薄切片研究了家兔和大鼠胃、肝、胰及舌淋巴管的微细分布。

5′-Nase-ALPase双重染色法可使毛细淋巴管和淋巴管呈棕色或深棕色，而毛细血管和血管则呈现蓝色，根据不同的颜色，两者是很容易区分的（图1-1）。

图1-1 大鼠胸腺淋巴管（5′-Nase-ALPase双重染色法×250，引自Kato，1990）

1.淋巴管 2.毛细淋巴管 3.小血管 4.毛细血管

二、淋巴管免疫组织化学显示法

20世纪80年代后期，Kaplar和Robinson等用单克隆抗体（B27）做免疫反应研究不同部位血管内皮形态和功能上的特点。1989年Ezaki等为了客观准确地区分淋巴管和血管，采用双免疫技术研究了大鼠小肠、膈和皮肤的淋巴管。我们也采用免疫组织化学方法研究了兔和大鼠起始淋巴管的分布。B27标记的内皮细胞呈红色，而抗基膜抗体Ⅳ型胶原蛋白（type Ⅳ collagen）标记的基膜呈现蓝色。由于毛细淋巴管壁缺少基膜，所以仅呈红色，而毛细血管则呈深蓝色（其内皮细胞呈淡红色），毛细淋巴管和毛细血管的区分也是很明显的（图1-2）。

此外，国外学者相继发现血管内皮生长因子受体3、Podoplanin、Prox-1、淋巴管内皮透明质酸受体1等为淋巴管较为特异敏感的标记分子。近年来，张雅芳等（2007—2011）在淋巴管的定性和定位研究中，应用上述的淋巴管标记物标记了各种癌组织的淋巴管（图1-3）。

图1-2 家兔小肠黏膜层淋巴管（免疫组织化学染色　×650，引自Ezaki，1990）

L.乳糜管 BC.毛细血管

图1-3 人恶性黑色素瘤组织淋巴管（免疫组织化学染色×200）

箭头示LYVE-1阳性的淋巴管