1.4　荧光光谱

分子发光分析主要包括分子荧光分析、分子磷光分析和化学发光分析。分子由基态激发至激发态，所需激发能可由光能、化学能或电能等供给。若分子吸收了光能而被激发到较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。荧光分析和磷光分析就是基于这类光致发光现象建立起来的分析方法。物质的基态分子受一激发光源的照射，被激发至激发态后，在返回基态时，产生波长与入射光相同或较长的荧光，通过测定物质分子产生的荧光强度进行分析的方法称为分子荧光分析。若在化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射称为化学发光或生物发光。根据化学发光强度或化学反应产生的总发光强度来确定物质含量的方法称为化学发光分析法。

分子荧光分析可应用于物质的定性及定量分析。由于物质结构不同，分子所能吸收的紫外光波长不同，在返回基态时，所发射的荧光波长也不同，利用这个性质可以对物质进行定性分析；对于两种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系，利用这个性质可进行定量分析。荧光分析法的主要特点是：①灵敏度高，检出限为10-7～10-9g·mL-1，比紫外-可见分光光度法高10～103倍；②选择性强，能吸收光的物质并不一定产生荧光，且不同物质由于结构不同，虽吸收同一波长的光，产生的荧光波长却不同；③用样量少、操作简便。荧光分析法的缺点是，由于许多物质不发射荧光，因此使它的应用范围受到限制。

目前，分子荧光分析应用日益增多，在高分子材料分析、分子生物学、免疫学、生物医学、环境监测、食品分析及农牧产品分析等方面应用日益广泛，本章主要介绍荧光光谱基本原理和方法及其在高分子材料分析中的应用。

1.4.1　荧光光谱基本原理与方法

荧光和磷光同属于发光光谱，反映了分子在吸收辐射能被激发到较高电子能态后，为了返回基态而释放出能量。荧光是分子在吸收辐射之后立即（在10-8s数量级）发射的光，而磷光则是在吸收能量后延迟释放的光。两者的区别是：荧光是由单态—单态的跃迁产生的，而磷光所涉及的是三重态—单态跃迁。

荧光光谱（molecular luminescence analysis）通过激发光谱和发射光谱提供包括荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等多个物理参数，具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点。尤其是荧光探针（probe）或标记（label）的引入极大地扩展了荧光光谱在高聚物研究中的应用。目前，荧光光谱已经深入到高聚物科学的各个领域，它能提供分子水平的信息，在高聚物构象、形态、动态以及共混相容性等方面的研究已取得显著的成功。

1.4.1.1　荧光光谱的基本原理

荧光光谱与紫外光谱一样都是电子光谱，不同的是前者为电子发射光谱，后者为电子吸收光谱。样品受到光源发出的光照射，其分子和原子中的电子由基态激发到激发态。激发态有两种电子态：一种为激发单线态，处于这种状态的两个电子的自旋是配对的（反相平行），自旋量子数的代数和s=0，保持单一量子态，即2s+1=1；第二种为激发三线态，处于这种状态的两个电子的自旋不配对（同相平行），自旋量子数的代数和s=1，在激发时分裂为3个量子态，即2s+1=3。

一般对分析上有用的荧光体系几乎都是含有一个或几个苯环的复杂有机化合物。这些化合物中能产生最强荧光的吸收过程通常是π→π*跃迁。

（1）分子的激发态

大多数分子含有偶数个电子，在基态，这些自旋成对的电子在各个原子或分子轨道上运动，方向相反。电子的自旋状态可以用自旋量子数（ms）表示，ms=±1/2。所以配对电子自旋总和是零。如果是一个分子所有的电子自旋是成对的，那么这个分子光谱项的多重性M=2s+1=1，此时，所处的电子能态称单重态，以s0表示。当配对电子中一个电子被激发到某一较高能级时，将可能形成两种激发态，一种是受激电子的自旋仍然与处于基态的电子配对（自旋相反），则该分子处子激发单重态，以s表示； 另一种是受激电子的白族与处于基态的电子不再配对，而是相互平行，s=1，2s+1=3，则分子是处于激发三重态，以T表示。

激发单重态与激发三重态的性质有明显不同。其主要不同点是：①激发单重态分子是抗磁性分子，而激发三重态分子则是顺磁性的；②激发单重态的平均寿命约为10-8s，而激发三重态的平均寿命长达10-4～1s；③基态单重态到激发单重态的激发容易发生，为允许跃迁，而基态单重态到激发三重态的激发概率只相当于前者的10-6，实际上属于禁阻跃迁；④激发三重态的能量较激发单重态的能量低。

（2）分子的去活化过程

分子中处于激发态的电子以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式最终回到基态，这一过程中，各种不同的能量传递过程统称为去活化过程。辐射跃迁主要是荧光和磷光的发射；无辐射跃迁是指分子以热的形式失去多余能量，包括振动弛豫、内转换、系间跨越、淬灭等。各种跃迁方式发生的可能性及程度与荧光物质分子结构和环境等因素有关。

当处于基态单重态（s0）的分子吸收波长为λ1和λ2的辐射后，分别被激发至第一激发单重态（s1）和第二激发单重态（s2）的任一振动能级上，而后发生下述失活过程。

① 振动弛豫　同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁，这一过程属无辐射跃迁，称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间为10-13～10-11s。

② 内转换　相同多重态电子能级中，等能级间的无辐射能级交换称为内转换。如第二激发单重态的某一较低振动能级，与第一激发单重态的较高振动能级间有重叠时，位能相同，可能发生电子由高电子能级以无辐射跃迁的方式跃迁至低能级上。此过程效率高，速度快，一般只需10-13～10-11s。通过内转换和振动弛豫，较高能级的电子均跃回到第一电子激发态（s1）的最低振动能级（ν=0）上。

③ 系间跨越　指激发单重态与激发三重态之间的无辐射跃迁。此时，激发态电子自旋反转，分子的多重性发生变化。如单重态（s1）的较低振动能级与三重态t1的较高振动能级有重叠，电子有可能发生自旋状态的改变而发生系间跨越。含有重原子（如碘、溴等）的分子中，系间跨越最为常见，这是由于高原子序数的原子中电子自旋与轨道运动之间相互作用较强，更有利于电子自旋发生改变的缘效。

④ 荧光发射　处于激发单重态的最低振动能级的分子，也存在几种可能的去活化过程。若以10-9～10-7s的时间发射光量子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生，称为荧光发射。

⑤ 磷光发射　分子一旦发生系间跨越跃迁后，接着就会发生快速的振动弛豫而达到三重激发态t1的最低振动能级（ν=0）上，再经辐射跃迁到基态的各振动能级就能发射磷光，这一过程称为磷光发射。这种跃迁，在光照停止后，仍可持续一段时间，因此磷光比荧光的寿命长。通过热激发，可能发生t1→s1的系间跨越，然后由s1发射荧光，这种荧光称延迟荧光。第一电子激发态三重态与单重态之间能量差较小，随振动耦合增加而增加内转换的概率，从而使磷光减弱或消失。另外，由于激发三重态的寿命较长，增大了分子与溶剂分子间碰撞而失去激发能的可能性，因此室温下不易观察到磷光现象。

⑥ 淬灭　激发分子与溶剂分子或其他溶质分子间相互作用，发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失，这一现象称为“淬灭”。

总之，激发态分子的去活化过程可归纳如下所示：

由于不同物质的分子结构及分析时所处的环境不同，因此各个去活化过程的速率也就不同。如果荧光发射过程比其他去活化过程速率更快。就可观察到荧光现象。相反，如果无辐射跃迁过程具有更大的速率常数，荧光将消失或强度减弱。

1.4.1.2　高聚物荧光光谱的研究方法

高聚物荧光光谱研究从方法上可分为直接测定法和间接测定法两种。直接测定法是利用高聚物自身发射的荧光进行分析的方法，又称为“自荧光”或“内源荧光”方法。间接测定法是引入荧光探针[即“探针”（probe）或“标记”（label）化合物]，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程以及检测某些特殊环境下材料的结构和物理性质的方法。所谓“探针”是将含生色团小分子用物理方法分散在高分子体系中，而“标记”则是指生色团以化学键连接在高分子链上。按不同研究目的，“标记”基团可以连接在链内或键端，同一分子链上可以含一种或两种不同的生色团。

间接测定法的基本特点是具有高灵敏度和极宽的动态时间响应范围，可用于体系稳态性质的研究和动态过程的监测。该方法所需探针试剂浓度极稀，仅10-9mol·L-1的浓度就能满足检测要求，对研究那些要求尽量减少外来分子影响的体系非常重要。值得注意的是，所选择的探针必须与被研究高聚物的某一微区具有特异性的结合，并且结合得比较牢固，同时探针试剂的荧光要对环境条件敏感，但又不能影响被研究高聚物的结构和特性。

间接测定法中引入的探针在高聚物体系中的旋转弛豫对高聚物的分子质量不敏感，只与其自由体积相关。不同类型的探针在激发后的构象变化所涉及的体积大小不同，可以反映出不同体积分数，因此可利用这一特点估测体系中不同自由体积的分布。按照弛豫机制的不同，探针至少可分为5种类型：①具有分子内电荷转移态的给体-受体分子探针（TICT）；②可形成激基缔合物的探针（Excimer）；③预扭曲TICT型探针；④异构体类Dewar型探针；⑤二苯乙烯类化合物的顺反异构化探针。不同类型的探针具有不同的检测极限，激基缔合物的形成和顺反异构化的变化能测得高聚物中较大的自由体积，而预扭曲的TICT型及Dewar型探针则测定体系中较小的自由体积，TICT型探针的检测范围介于两者之间。

1.4.2　分子荧光光谱仪

1.4.2.1　荧光光谱分析仪基本结构流程

荧光分析通常用荧光分光光度计，与其他光谱分析仪器一样，主要有光源（激发光源）、样品池、单色器系统及检测器四部分组成。不同的是荧光分析仪器需要两个独立的波长选择系统，一个为激发单色器，可对光源进行分光，选择激发波长；另一个用来选择发射波长，或扫描测定各发射波长下的荧光强度，可获得试样的发光光谱。检测器与激发光源成直角。荧光分析仪器的基本结构流程如图1-42所示。

（1）激发光源　激发光源应具有强度大，稳定性好、适用波长范围宽等特点。因为光源的强度直接影响测定的灵敏度，而光源的稳定性直接影响到测定的重复性和精确度。常用的光源有高压汞灯氙灯和卤钨灯。高压汞灯常用在荧光计中，发射光强度大而稳定。荧光分析中常用365nm、405nm、436nm三条谱线但不是连续光谱。分光荧光计所用的光源大都采用150W和500W的高压氙灯作为光源，发射强度大能在紫外-可见光区给出比较好的连续光谱可用于200～700nm波长范围，在200～400nm波段内辐射线强度几乎相等。单氙灯需要稳定光源以保证光源的稳定。

（2）单色器　荧光分光光度计有两个单色器——激发单色器和发射单色器。激发单色器放于光源和样品池之间起作用是让所选择的激发光透过并照射于被测试样上。放于试样和检测器之间的为发射单色器，它的作用是把激发光所发生在容器表面的杂散光滤去，让荧光物质发出的荧光通过且照射到检测器上。

荧光计用滤光片作单色器，分激发滤光片和荧光滤光片。它们的功能比较简单，价格也便宜，适用于固定试样的常规分析。大部分分光荧光计采用光栅作为单色器。在测定激发光谱时，应固定发射单色器波长，而扫描激发单色器波长；而当测定荧光物质的荧光光谱时，则应固定激发单色器波长，扫描发射单色器的波长。

（3）狭缝　在仪器上狭缝是用来调节一定的光通量和单色性的装置。狭缝越小单色性越好，但光强和灵敏度降低。因此通常狭缝应调节到既有足够大的光通量，同时也有较好的分辨率为宜。

（4）样品池　荧光分析用的样品池需用低荧光材料，常用石英池。有的荧光分光光度计附有恒温装置。测定低温荧光时，在石英池外套上一个盛有液氮的石英真空瓶，以便降低温度。

（5）检测器　荧光的强度比较弱，因此要求检测器有较高的灵敏度。在荧光计中常用光电池或光电管；在一般较精密的分光荧光光度计中常用光电倍增管检测。为了改善信噪比，常采用冷却检测器的办法。二极管阵列和电荷转移检测器的使用，更大程度上提高了仪器测定的灵敏度，并可以快速记录激发和发射光谱，还可以记录三维荧光光谱图。

荧光光谱仪与紫外光谱仪、红外光谱仪的不同之处主要有两点：一是它有两个单色器，在样品池前设一激发单色器，光经激发单色器滤光后照射样品池，样品产生的荧光经过第二个单色器-发射单色器后进入检测器；二是为了避免激发单色器的辐射光被检测，在垂直于入射光的方向测定荧光或磷光的相对强度。进行磷光测定时，在样品室内必须装有带石英窗的特殊杜瓦瓶和石英试样管。 如果在荧光计的样品池前后的光路中分别加偏振器和检偏器，还可以测量偏振荧光。荧光光谱仪的光源一般用氙灯或高压汞灯。而有些文献中介绍的X荧光光谱仪则是用X射线或放射性同位素辐射源照射样品，将其原子中的某内层电子轰击出来成为自由电子，并在内层形成电子空穴。当其他内层电子发生层间窜跃进入空穴时发生辐射，产生荧光X射线。有这种荧光X射线的波长和强度可以获得元素的种类和含量等信息。这两种荧光分析方法的原理和研究内容是不同的，应加以区别。

先进的荧光光谱仪既能测定液体样品又能测定固体样品。聚合物的研究多用溶液体系，溶液的浓度一般为10-5～10-4mol·L-1，用石英液槽进行测定。测定液体样品时，要慎重选择溶剂：一是要选择非极性或极性很小的溶剂；二是要求溶剂本身的吸光度小；三是要保证溶剂的纯度。无机发光材料的研究一般用固体样品，可将样品压成片状，放在小托盘中，样品平面与入射角成45°放置。

1.4.2.2　荧光强度与荧光量子产率

并不是任何物质都能发射荧光，能产生荧光的分子称为荧光分子。分子结构与荧光的发生及荧光强度的大小紧密相关。

稀溶液中的荧光强度I可出式（1-23）计算：

I=ΦFK'AI0　　（1-23）

式中，ΦF为荧光量子产率，代表处在电子激发态的分子放出荧光的概率；K'为检测效率，是与荧光仪结构有关的参数，并与样品和聚光镜之间的距离、检测器的灵敏度有关；A为吸光度；I0为入射光的强度。

分子产生荧光必须具备两个条件：①具有合适的结构。荧光分子通常为含有苯环或稠环的刚性结构有机分子，如典型的荧光物质荧光素的分子结构；②具有一定的荧光量子产率。由荧光产生过程可知，物质分子在吸收了特征频率的辐射能之后，必须具有较高的荧光效率，用ΦF表示，常称为荧光量子产率。

荧光量子产率的定义为：

ΦF=　　（1-24）

在产生荧光的过程中，涉及许多辐射和无辐射跃迁过程。很明显，荧光效率将与上述每个过程的速率常数有关。若用数学式表示，得到

ΦF=　　（1-25）

式中，kF为荧光发射过程的速率常数，主要取决于物质的化学结构；∑ki为其他有关过程的速率常数的总和，主要取决于产生荧光的化学环境，同时也与物质的化学结构有关。显然，凡是能使kF值升高并使物质ki值降低的因素，都可增强荧光。高荧光物质如荧光素，其ΦF值在某些情况下接近于1，说明∑ki很小，可以忽略不计。多数物质的ΦF值一般都小于1，如罗丹明B的乙醇溶液ΦF=0.97；蒽的乙醇溶液ΦF=0.30。荧光效率大，在相同浓度下，荧光发射的强度IF也大。当ΦF=0时，就意味着不能发射荧光。

荧光量子产率是一个物质荧光特性的重要参数，它反映了荧光物质发射荧光的能力，其值越大物质发射的荧光越强。

1.4.2.3　荧光谱图

一台荧光光谱仪可对任何一种荧光试样提供两种荧光谱图：荧光激发光谱（excitation spectrum）和荧光发射光谱（emission spectrum）。荧光激发光谱是固定发射单色器的波长λem及狭缝宽度，使激发单色器的波长连续变化，从而得到荧光激发扫描谱图，其纵坐标为相对荧光强度，横坐标为激发光的波长。荧光发射光谱通常称为荧光光谱，它是固定激发单色器的波长λex及狭缝宽度，使发射单色器的波长连续变化，从而得到荧光发射扫描谱图，其纵坐标为相对荧光强度，横坐标为发射光的波长。荧光光谱与紫外-可见光谱在聚合物的分析中往往同时使用，相互印证。其中，荧光激发单色器波长λex的固定数值可通过测定样品的紫外-可见光谱的最大吸收所对应的波长值来确定；荧光发射单色器波长λem的固定数值可通过荧光发射光谱的最大强度所对应的波长值来确定。

图1-43 给出了蒽的甲醇溶液（0.3μg·ml-1）测得的发射和激发光谱。其中，曲线A是从350～500nm的发射光谱；曲线B是激发光谱，波长从220～390nm。激发光谱中每一谱带的波长位置与紫外-可见吸收光谱中谱带的位置是一样的。从图中还可以看出，蒽的发射光谱与激发光谱互为映像。

1.4.2.4　荧光与分子结构的关系

（1）跃迁类型　实验证明，对于大多数荧光物质分子来说，存在π*→π和π*→n跃迁的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数较小，有利于荧光的产生。在这两种跃迁类型中，π*→π跃迁常能发出较强的荧光（较大的荧光效率），这主要是由于π→π*跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一般比n→π*跃迁大102～103倍）。

（2）共轭效应　提高π电子共轭程度的结构，有利于增加荧光效率并产生红移。如对苯基化、间苯基化和乙烯基化的作用会增加光的强度，并使荧光光谱红移，见表1-11。含有脂肪族和脂环族碳基结构或高共轭双键结构的化合物也可能发生荧光，如含有高共轭双键的脂肪烃维生素A也有荧光，但这一类化合物数目要比芳香类化合物少。

（3）刚性平面结构　分子具有刚性的不饱和的平面结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有较高的荧光效率。分子刚性及共平面性越大，荧光效率越高，并使荧光波长红移。例如酚酞和荧光素有相似结构，但荧光素中多1个氧桥，使其具有刚性平面结构，因而荧光素有强烈荧光，而酚酞的荧光却很弱。某些螯合剂本身不发生荧光或荧光较弱，但与金属离子螯合后，平面构型和刚性增强，就可发生或增强荧光。例如，8-羟基喹啉是弱荧光物质，当与Zn2+、Mg2+、Al3+螯合后，荧光就增强。相反，如果原来结构中平面性较好，但分子上取代了较大基团后，由于位阻的原因，使分子的共平面性下降，因而荧光减弱。表1-12表明1-二甲胺基萘-8-磺酸盐的荧光效率最低，这是因为磺酸基团与二甲胺基之间的位阻效应，使分子发生扭转，两个环不能共平面，因而使荧光大大减弱。

同理，对于顺反异构体，顺式分子的两个基团在同一侧，由于位阻原因不能共平面，而没有荧光。例如，1，2-二苯乙烯的反式异构体有强烈荧光，而顺式异构体没有荧光。

（4）取代基效应　芳香环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大影响。通常给电子基团使荧光增强，如—OH、—NH2、—NR2、—OR等；而同π电子体系相互作用较小的取代基如—SO3H和烷基对分子荧光影响不明显；吸电子基团，如—COOH、—CO、—NO2、—NO、—NN—及卤素会减弱甚至破坏荧光。

了解荧光和物质分子结构的关系，可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，或将荧光强度不大或选择性较差的荧光物质转化为荧光强度大及选择性好的荧光物质，以提高分析测定的灵敏度。

1.4.2.5　仪器的灵敏度

分光荧光计的灵敏度与三个方面有关：①与仪器的光源强度、单色器（包括透镜、反射镜等）的性能、放大系统的特征和光电倍增管的灵敏度有关；②和所选用的波长及狭缝宽度有关；③和被测定的空白溶剂的拉曼散射、激发光、杂质荧光等有关。由于影响荧光计灵敏度的因素很多，同一型号的仪器，甚至同一台仪器，在不同时间操作所测得的结果也不尽相同。目前，荧光分析仪器的灵敏度趋向使用纯水的拉曼峰信噪比（S/N）表示。以纯水拉曼峰高为信号值（S），确定发射波长，使记录仪进行时间扫描，测出仪器的噪声信号（N），用S/N的值作为衡量仪器灵敏度的指标。一般其值在20～200之间，此法应用比较广泛。

1.4.2.6　激发光谱和荧光光谱的形状及其相互关系

（1）激发光谱　如果将激发光的光源用单色器分光，测定不同波长的激发光照射下，荧光最强的波长处荧光强度的变化，以激发波长λ为横坐标，荧光强度IF为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱。

（2）发射光谱　简称荧光光谱。如果将激发光波长固定在最大激发波长处，而让物质发射的荧光通过单色器分光，以测定不同波长的荧光强度。以荧光的波长λ作横坐标，荧光强度IF为纵坐标作图，便得到荧光光谱。如图1-44所示。

荧光物质的最大激发波长（λex）和最大荧光波长（λem）数据，也是定量测定时最灵敏的条件。比较蒽的荧光光谱和激发光谱（吸收光谱）的形状可见，荧光光谱和激发光谱呈现大致的镜像对称关系。蒽的乙醇溶液有两个吸收带：一个峰在250nm波长处的吸收带，相应从基态到第二激发态的跃迁；另一个峰在350nm波长处的吸收带，相应从基态到第一激发态的跃迁。但由于内转换及振动弛豫的速度远远大于由S2返回基态发射荧光的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一激发态的最低振动能级回至基态的各个振动能级，所以荧光光谱只能出现一个谱带。即无论用λ1、λ2或λ3波长激发，荧光光谱的形状、位置都相同。荧光光谱是受激分子从S1的最低振动能级回至基态中各振动能级所致，其形状决定于基态的振动能级的分布情况。由于激发态与基态的振动能级分布类似，因此荧光光谱和激发光谱形状相似，呈镜像对称。

1.4.3　分子荧光光谱的定量分析

1.4.3.1　荧光强度与溶液浓度的关系

当一束强度为I0的紫外光照射一盛有浓度为c、厚度为l的液池时，可在液相的各个方向观察到荧光，其强度为IF，透射光强度为It，吸收光强度Ia。由于激发光的一部分能透过液池，因此，一般在激发光源垂直的方向测量荧光强度（IF），见图1-45。溶液的荧光强度和该溶液的吸收光强度以及荧光物质的荧光效率有关。

IF=ΦFIa

根据Lambert-Beer定律：

Ia=I0-It

=10-εlc

It=I0×10-εlc

Ia=I0-I0×10-εlc=I0（1-e-2.303εlc）

对于很稀的溶液，将上式按Taylor展开，并作近似处理后可得

IF=2.303ΦFI0εlc

当荧光效率（ΦF）、入射光强度（I0）、物质的摩尔吸光系数（ε）、液层厚度（l）固定不变时，荧光强度（IF）与溶液的浓度（c）成正比。可写成

IF=Kc　　（1-26）

式（1-26）即为荧光分析的定量基础。但这种关系只有在极稀的溶液中，当εlc<0.05时才成立。对于εlc>0.05较浓的溶液，由于荧光猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度与浓度不呈线性关系，荧光强度与浓度的关系向浓度轴偏离。

1.4.3.2　测定条件的选择

（1）选择合适的激发光波长和荧光波长　一般选择激发光谱中能产生最强荧光的入射光波长作为激发光，称为最大激发波长（λex）。根据荧光光谱选择最强荧光的波长作为荧光测定的波长。

（2）选择线性范围　当荧光物质溶液的吸光度A≤0.05时，荧光强度和浓度才呈线性关系。当高浓度（A>0.05）时，由于自淬灭和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性，发生负偏差。因此分析时应注意在校正曲线的线性范围内进行。

1.4.3.3　定量分析方法

（1）校正曲线法　配成一系列不同浓度的标准溶液。然后，测出标准溶液的相对荧光强度和空白溶液的相对荧光强度。以相对荧光强度为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标，绘制校正曲线；然后将处理后的试样，配成一定浓度的溶液，在同一条件下测定其荧光强度，从校正曲线上求出试样中荧光物质的含量。

为了使一个实验在不同时间所测的数据前后一致，在测绘校正曲线时或者在每次测定试样前，常用一个稳定的荧光物质（其荧光峰与试样的荧光峰相近）的标准溶液作为基准进行校正。例如，在测定维生素B1时，采用硫酸奎宁作基准。

（2）比较法　取已知量纯荧光物质配成在线性范围内的标准溶液，测出荧光强度（IF（s）），然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度（IF（x））。分别扣除空白（IF（0））的含量。以标准溶液和试样溶液的荧光强度比，求试样中荧光物质。

=　　（1-27）

cx=cs　　（1-28）

（3）多组分混合物的荧光分析　如果混合物中各组分荧光峰相互不重叠，则可分别在不同波长测量各个组分的荧光强度，从而直接求出各个组分的浓度。Al3+和Ga3+的8-羟基喹啉配合物的氯仿萃取液荧光峰均为520nm，但激发峰不同，可分别在365nm及435.8nm激发，在520nm处测定互不干扰。若不同组分的荧光光谱相互重叠，则可利用荧光强度的加合性质，在适宜波长处测量混合物的荧光强度，再根据被测物质各自在适宜波长处的最大荧光强度，列出联立方程，求它们各自的含量（可参见紫外-可见分光光度法多组分混合物的定量分析）。

1.4.4　影响荧光光谱强度的因素

荧光分子所处的外部化学环境，如温度、溶剂、pH等都会影响荧光效率，因此选择合适的条件不仅可以使荧光加强，提高测定的灵敏度，还可以控制干扰物质的荧光产生，提高分析的选择性。

（1）温度的影响　大多数荧光物质的溶液随着温度降低，荧光效率和荧光强度将增加；相反，温度升高，荧光效率将下降。如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光效率增加3%；冷至-80℃，荧光效率为100%。这是由于当温度降低时，溶液中分子的活动性减弱，溶剂化度降低，溶质分子与溶剂分子间碰撞机会减少，降低了无辐射去活概率，使荧光效率增加。

（2）溶剂的影响　溶剂对荧光强度和形状的影响主要表现在溶剂的极性、氢键及配位键的形成等。溶剂极性增大时，通常使荧光波长红移。氢键及配位键的形成更使荧光强度和形状发生较大的变化。含有重原子的溶剂，如CBr4和CH3CH2I等也可使荧光强度减弱。

（3）溶液pH的影响　当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，其荧光强度受溶液pH值的影响较大。例如苯胺在pH=7～12溶液中会发生蓝色荧光，在pH<2或pH>13的溶液中都不发生荧光。有些荧光物质在离子状态无荧光，而有些则相反；也有些荧光物质在分子和离子状态时都有荧光，但荧光光谱不同。

（4）溶液荧光的猝灭　荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象，称为荧光猝灭。引起荧光猝灭的物质称为猝灭剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等均为常见的猝灭剂。

引起荧光猝灭的因素很多。碰撞猝灭是荧光猝灭的主要原因，它是指处于单重激发态的荧光分子与猝灭剂碰撞后，使激发态分子以无辐射跃迁回到基态，因而产生猝灭作用。除碰撞猝灭外，还有静态猝灭、转为三重态的猝灭、自吸猝灭等。静态淬灭是指荧光分子与淬灭剂生成不能产生荧光的物质。O2是最常见的猝灭剂，荧光分析时需要除去溶液中的氧。荧光分子由激发单重态转入激发三重态后也不能发生荧光。浓度高时，荧光分子发生自吸收现象也是发生荧光淬灭的原因之一。荧光物质的荧光光谱与吸收光谱重叠时，荧光被溶液中处于基态的分子吸收，称为自吸收。

1.4.5　分子荧光光谱在高分子材料分析中的应用

荧光光谱法应用在高分子材料研究中虽然只有20年的历史，然而其应用已深入到高分子科学中许多领域。由于其灵敏度极高，在高分子溶液、共混物等方面的研究十分引人注目。

1.4.5.1　高分子在溶液中的形态转变

合成聚合物的激基缔合物荧光最早是在聚苯乙烯溶液中发现的，聚苯乙烯在溶液中的激基缔合作用已被许多学者所研究。所谓高分子溶液中的激基缔合物，是指对于像聚苯乙烯这类聚合物中的苯环或其他芳环等具有平面π电子共轭结构的发色基团，除单独存在外，还有可能出于分子链处于某种构象时，邻近的两平面结构相互平行靠近产生相互作用，从而形成一种激基缔合物（eximer）。这种激基缔合物吸光后发出了不同于单独发色基团（monomer）的异常荧光。反映在荧光谱图上，就表现为聚合物（如聚苯乙烯）溶液的荧光谱峰与相应的结构单元（如乙苯）的荧光谱峰有明显不同。

1.4.5.2　高分子共混物的相容性和相分离

不同品种的高分子均聚物共混，有可能获得具有新的功能，或综合两者优点的新材料体系。自20世纪70年代以来，这一领域的研究有了很快的发展。组成共混物的高分子间若存在特殊相互作用，包括氢键、偶极-偶极、离子-离子、电荷转移络合等，便会产生有利于互相溶解的混合焓，因而形成相容体系。用荧光光谱法表征高分子共混体系的相容性主要有两种方法：激基缔合物法和Forster能量转移法。

Frank发展了用含芳香基均聚物的激基缔合物来研究高聚物相容性的技术。用0.2%聚-乙烯萘与不同的聚烷基丙烯酸甲酯共混，发现随两组分溶度参数差增大而升高。当溶度参数差接近零时，最小，表明两组分以分子水平相容。后来Frank又将该技术用于研究PS/乙烯基甲基醚共混物的相分离。对于聚苯乙烯-聚乙烯基甲基醚体系，从甲苯溶液中成膜表现出相容的性质，从THF溶液中成膜则出现相分离。在相同的聚苯乙烯含量时，相分离体系的远高于相容体系。钱人元等发现，对从甲苯中成膜的聚苯乙烯-聚乙烯基醚体系，聚苯乙烯含量低于5%（质量分数）时，为一常数，小于聚苯乙烯在良溶剂中的数值，这表明两种聚合物以分子水平相容。

江明等用荧光光谱法研究了含氢键体系的相容性。所用的含荧光生色团的聚合物是乙烯基萘（VN，90%）和少量甲基丙烯酸甲酯（MMA）的共聚物（PVM），后者提供了与对应聚合物生成氢键的羰基，与之共混的对应聚合物为含羰基的聚苯乙烯[PS（OH）]在羟基含量很低时，几乎不随—OH的含量而改变，表明了PVM在PS（OH）中的状态是独立成形的。在羟基含量较高（>2.8%）时，在一个低值的水平上保持不变，这表明体系中形成激基缔合物的可能性大为减少，即PVM已和PS（OH）充分贯穿和均匀混合了。介于此两区域之间，明显的存在一个转变区。氢键作用的增强使PVM链由自身聚集的状态过渡到在PS（OH）基质中的充分均匀混合。荧光光谱法给出的如此低含量下的相容行为的变化，是其他相容性技术如DSC或动态力学方法等所无法观察到的。

激基缔合物法仅适用于研究含生色团的均聚物的共混体系。而Forster能量转移法却具有更普遍的意义。这一方法的基本原理在于：当某种体系中同时存在一种荧光能量给体D（donor）和一种能量受体A（acceptor）时，它们之间的能量转移效率E与其间的距离的6次方成反比，即E=1/[1+（D/R0）6]。这里的D是两生色团之间的距离，R0是所谓特征距离，它取决于D的发射光谱和A的吸收光谱间重叠的程度及体系的折光指数等。对给定的体系来说，它是一个常数。通常R0值为2～4nm，由于生色团间的能量转移效率强烈依赖于两者距离，如将两种荧光生色基团分别标记到两种聚合物上，则可通过其能量转移效率的变化来了解2～4nm尺度下异种分子间相互混合的程度。显然，体系由相分离状态向相容性状态变化时，其能量转移效率将有较大的增加，因为前者只有在两相界面上才发生能量转移。

1.4.5.3　研究高聚物的降解与老化

高聚物的降解和老化过程可以利用中间和最终产物中基团的荧光光谱变化进行动态的描述。图1-46给出了某种聚酯膜在300℃经不同时间热降解后在330nm波长激发时的荧光发射光谱。结果显示热降解后荧光发射强度明显增加，发射波长随热处理时间的延长而红移（由1h的38nm移至5h的415nm），同时热处理2h后在450nm处出现宽肩峰。这些结果表明热老化过程由两个协同效应组成，即经热分解化作用形成单羟基单元，随之快速发生双羟基化反应生成双羟基单元。聚酯膜经紫外光降解不同时间后在330nm波长激发时的荧光发射光谱见图1-47，其变化与热老化不同。光降解后在460nm处的荧光发射强度虽处理时日的延长而显著增强，但无红移现象，由此表明光降解后主要的反应是单羟基化的快速反应，仅生成极少量的双羟基单元；进一步分析还说明光老化在形成高聚物的短链段的同时伴有结构的重排和聚集。

1.4.5.4　发光聚合物材料的荧光光谱研究

为研究聚合物发光材料，往往将小分子发光物质引入聚合物长链中。例如，图1-48显示出取代肉桂酸单体铕盐与相应的聚合物的荧光谱，其激发光波长固定在241.1nm。曲线1为取代肉桂酸单体铕盐，曲线2为其聚合物。可见，取代肉桂酸单体铕盐的荧光强度大，聚合后荧光减弱，在700nm处峰的变化尤为明显。铕（Eu）是稀土金属，具有一定数目的共轭单体的低分子有机配体与稀土金属盐形成的有机盐类有较高的发光效率，其单体聚合后，由于羧酸盐基聚集引起亚微观的不均匀性，导致Eu3+的荧光部分淬灭，致使荧光强度减弱。

1.4.5.5　常用荧光试剂及使用范围

目前分子荧光分析法被广泛用于高分子材料分析中。分子荧光分析已经成为了非常灵敏的测定方法。

常用的荧光试剂见表1-13。