实验四 米氏常数和最大反应速率的测定
一、实验目的
1.了解米氏方程的含义及其重要意义。
2.掌握测定米氏常数（Km）和最大反应速率（vmax）的基本原理。
3.掌握Km和vmax的测定方法。
二、实验原理
在温度、pH和酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速率有很大影响（图4-1）。在底物浓度很低时，酶促反应速率（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度继续增加，反应速率的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速率达到一个极限值（vmax）。
图4-1 底物浓度对反应速率的影响
底物浓度与反应速率的这种关系可用米氏方程表示：
式中，v为反应速率；Km为米氏常数；vmax为酶促反应最大速率；［S］为底物浓度。
从米氏方程可见，米氏常数Km等于反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位（mol/L或mmol/L）。在酶学分析中，Km是酶促反应的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关，与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。测定Km、vmax一般用作图法。作图法有很多种，最常用的是Linewaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/v对1/［S］作图，可得到一条直线。直线在横轴上的截距为-1/Km，纵轴截距为1/vmax，可求出Km与vmax（图4-2）。
图4-2 双倒数作图法
三、试剂与器材
1.试剂
（1）酸性磷酸酯酶原酶液（从绿豆芽中提取）。
（2）0.05mol/L柠檬酸缓冲液（pH5.0）。
（3）酸性磷酸酯酶溶液： 将原酶液用0.05mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，使测定的第5号管OD405nm在0.6～0.7之间。
（4）1.2mmol/L NPP溶液：称取NPP 0.4454g，用缓冲液溶解并定容至1000mL。
（5）0.3mol/L NaOH溶液。
2.器材
恒温水浴锅，可见分光光度计，试管，移液枪，计时器。
四、实验步骤
1.酶促反应
取10支试管按表4-1编号。1～5号管加入各不相同的底物浓度样品，并设空白管。各空白管在加入NPP和缓冲液后，先加入0.3mol/L NaOH溶液，再加入酶液。其余各管按表4-1操作。精确反应15min后，各管加入0.3mol/L NaOH溶液终止反应。
表4-1 酶促反应各试管物质加入量
2.测定OD405nm值
终止各管反应，待冷却后以1～5号管中相应底物浓度作空白，在可见分光光度计上测定OD405nm值。
3.数据处理
通过测定，得到一组数据OD405nm，由于酶促反应产物对硝基盐离子在0.1～0.2mol/L NaOH溶液中，在405nm处的摩尔消光系数为18.8×103，则OD405nm值与反应速率的换算为：
式中，OD405nm为每管测定光密度值；t为反应时间，min。
反应液中底物浓度换算式：
式中，X为底物加入量，mL；3指反应液体积，mL；M为加入时的底物浓度，mmol/L。
通过计算求得［S］、v、1/［S］、1/v等值，然后作双倒数图，获取纵、横截距，求出Km和vmax值。
五、注意事项
注意精确反应15min后，加入0.3mol/L NaOH溶液终止反应时，应确保摇晃振动试管，使溶液混合均匀。
六、作业及思考题
1.绘制1/v-1/［S］直线图，计算Km和vmax值。
2.最大反应速率的确定有何意义？