实验七 蛋白质等电点的测定
（一）酪蛋白等电点的测定
【原理】
蛋白质在酸性或碱性溶液中，分别带有正、负电荷，它们互相排斥，不容易生成沉淀，当溶液的pH值改变而使蛋白质分子所带有的正、负电荷数接近相等时，即失去同电相斥的作用。因此，蛋白质分子很容易彼此结合而沉淀，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。
在本实验中用酪蛋白的醋酸钠溶液与不同的醋酸组成5种不同pH值的缓冲溶液，观察并比较各管中酪蛋白的溶解度，其中沉淀最多的试管之pH值即为酪蛋白的等电点。
【操作】
（1）给5支大试管编号，分别按表2-7-1准确加入试剂，混匀。
表2-7-1
（2）于各试管中加入酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，随加随摇（切勿在各管加完后才摇），观察各管浑浊度。静置10～30分钟后，比较各管浑浊度，用（+）号表示其浑浊程度。沉淀最多而上清液较透明的试管的pH值，即为酪蛋白的等电点。填写实验报告。
【试剂】
（1）0.01mol/L醋酸。
（2）0.1mol/L醋酸。
（3）1mol/L醋酸。
（4）0.5%酪蛋白的醋酸钠溶液，称取纯酪蛋白0.25g，置于50mL容量瓶内，准确地加蒸馏水20mL及1mol/LNaOH 5mL，摇匀，使酪蛋白溶解，然后准确地加1mol/L醋酸液5mL，最后用蒸馏水稀释至刻度。
（二）血红蛋白在三种不同pH值缓冲液中的电泳
【原理】
血红蛋白是有色物质，不须染色就可观察它在电场中的泳动情况。而在不同的pH值溶液中的泳动各有不同。本实验取三种不同pH值溶液进行比较，其中pH值6.8接近它的等电点（6.79）。
【操作】
（1）在3只电泳槽中分别加入pH值10.0、6.8和4.0缓冲液。
（2）取1.5cm×10cm醋酸纤维薄膜3条，各在正中处用铅笔画一短线作原线。分别用上述三种缓冲液浸透，用于滤纸吸干，各于原线点样（约5μL血红蛋白）。然后各放入相应的电泳槽（如用pH值10.0缓冲液的必须放入pH值10.0的电泳槽中），摆在槽的正中，使两端的缓冲液离原线等远。
（3）进行电泳。电压：约150V。时间：20～60分钟。观察结果，并解释之。
【试剂】
（1）pH值6.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（0.1mol/L柠檬酸22.75mL,0.2mol/L磷酸氢二钠77.25mL）。
（2）pH值4.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（0.1 mol/L柠檬酸61.56mL,0.2mol/L磷酸氢二钠38.55mL）。
（3）pH值10.0碳酸缓冲液（0.05mol/L碳酸氢钠50mL与0.1mL/L NaOH 10.7mL，加水稀释至100mL）。
（4）血红蛋白溶液，取抗凝血5mL，离心除去血浆，用0.9%NaCl洗涤血细胞3次，每次用5mL，要把血细胞搅起，离心后尽量倒去上清液。加水5mL，混匀，放冰箱过夜使之充分溶血，离心10～15分钟（2000r/min），使血细胞膜残骸沉淀，取上清透明液放冰箱备用。